تشخيص جهشهاي گيرنده FLT3 شامل تضاعف توالي داخلي و جهش نقطهاي اسيد آسپارتيك D835 در بيماران مبتلا به لوسمي ميلوي يدي حاد

Transcript

1 3 تشخيص جهشهاي گيرنده FLT3 شامل تضاعف توالي داخلي و جهش نقطهاي اسيد آسپارتيك D835 در بيماران مبتلا به لوسمي ميلوي يدي حاد *دكتر فرهاد ذاكرI محمد حسين محمديII دكتر احمد كاظميIII معصومه بخشايشIV چكيده زمينه و هدف: اساس مولكولي لوسمي ميلوي يدي حاد AML) ) Acute Myeloid Leukemia - موتاسيون در ژنهاي تنظيمكننده تكثير و تمايز سلولي ميباشد.جهش در ژن گيرندة تيروزين كينازي FLT3 از شايعترين جهشهاي ايجادشده در AML ميباشد كه موجب تكثير و بقاء غيرطبيعي سلولهاي لوكميك ميشود. وجود جهش تضاعف توالي داخلي (Internal Tandem duplication) ITD و همچنين جهش نقطهاي D835 ژنFLT3 يك پيشاگهي بد را به همراه دارند. هدف از اين مطالعه تشخيص و تعيين فركانس اين جهشها در بيماران مبتلا به AML بود. روش بررسي: 101 بيمار مبتلا به AML با روش مشاهدهاي- توصيفي از نظر جهش ITD در اگزون 11 و 12 و اينترون 11 و جهش نقطهاي D835 در اگزون 20 ژن گيرنده FLT3 با استفاده از تكنيك (Polymerase chain reaction) PCR مورد مطالعه قرار گرفتند. جهش ITD بعد از حركت باند حاصل از PCR ژن گيرنده FLT3 روي ژل آكريلاميد %8 و مقايسه با ماركر بر روي اين ژن مشخص گرديد. در مورد جهش نقطهاي D835 بعد از PCR روي DNA ژنوميك اين بيماران محصولات به دست آمده با استفاده از آنزيم محدودالاثر ECORV و تكنيك (Restriction RFLP Polymorphism) Fragment Length مورد مطالعه قرار گرفتند. يافتهها: جهش ITD در %18 مبتلايان به AML مورد مطالعه مشاهده گرديد كه براي زيرگروههاي مختلف طبقهبندي FAB اين نتايج متفاوت بود. %6 ه م ج ه ش نقطهاي D835 داشتند كه توزيع آنها در زيرگروههاي مختلف FAB يكسان نبود. نتيجهگيري: اين مطالعه نشان داد كه جهشهاي ژن گيرنده FLT 3 درصد قابل توجهي از بيماران مبتلا به لوسمي ميلوي يدي حاد را شامل ميشود كه ميتوان با تشخيص مولكولي اين جهشها قبل از شروع درمان در مورد پروتكل درماني صحيح تصميم گرفت. كليدواژهها: 1- لوسمي ميلوي يدي حاد 2- ژن گيرنده تيروزين كينازيFLT3 4- اسيد آسپارتيك (D835) 5- واكنش زنجيرهاي پليمراز تضاعف توالي داخلي مقدمه لوسمي ميلوي يدي حاد با افزايش تعداد ميلو بلاستها و سلولهاي نارس در مغز استخوان و خون محيطي همراه است و عوامل مختلفي در ايجاد آن دخيل هستند كه جهشهاي تا ثيرگذار در تكثير و تمايز سلولي از مهمترين آنها ميباشد. ژن گيرنده FLT3 (گيرنده تيروزين كينازي شبه - (FMS كه اغلب تحت عنوان flk-2 (كيناز كبدي جنيني- 2 ) شناخته ميشود از گيرندههاي خارج سلولي پيشسازهاي خوني و متعلق به خانواده گيرندههاي تيروزين كينازي كلاس III (RTKIII) ميباشد كه از 5 ناحيه شبه ايمنوگلوبولين در قسمت خارج سلولي و يك ناحيه كينازي در قسمت داخل سلولي تشكيل شده و اين دو قسمت توسط ناحيه غشا گذر به هم ) و 1 (2 متصل ميشود. اين ژن در بازوي كوتاه كروموزوم 13 (13q12,2) قرارگرفته و در سلولهاي خونساز نابالغ جفت (3) گنادها و مغز بيان ميشود. اين گيرنده با ساير تيروزين ) و 4 (5 كينازها از قبيل KIT و PDGFR مشابهت دارد. بروز زياد ژن گيرنده FLT3 در حدود %70 تا %100 از موارد AML و اين مقاله خلاصهاي است از پاياننامه آقاي محمدحسين محمدي جهت دريافت درجه كارشناسي ارشد هماتولوژي با راهنمايي دكتر فرهاد ذاكر و مشاوره دكتر احمد كاظمي سال I) دانشيار و متخصص هماتولوژي مركز تحقيقات سلولي و ملكولي گروه هماتولوژي دانشكده پيراپزشكي تقاطع بزرگراههاي شهيد همت و چمران دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ايران تهران ايران (*مو لف مسو ول) (II كارشناس ارشد هماتولوژي گروه هماتولوژي دانشكده پيراپزشكي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي- درماني ايران تهران ايران (III دانشيار و متخصص هماتولوژي گروه هماتولوژي دانشگاه پيراپزشكي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي- درماني ايران تهران ايران (IV كارشناس ارشد انگلشناسي مركز تحقيقات سلولي و ملكولي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي- درماني ايران تهران ايران 79

2 در درصد بالايي از موارد ALL (لوسمي لمفوي يدي حاد) اتفاق (6-8) ميافتد. ليگاند (FL) FLT3 هم در اكثريت ردههاي (9) سلولي بيان ميشود. جهشها در ژن گيرنده FLT3 بيشترين فراواني نقص ژنتيكي را شامل ميشوند كه در لوسمي ميلوي يدي حاد تعريف شدهاند. اصليترين اين جهشها جهش شناخته شده تضاعف توالي داخلي ( ITD )و جهش نقطهاي در موقعيت D835 ميباشند. نتيجه اين جهشها فعاليت تيروزين كينازي مداوم و پايدار گيرنده FLT3 ب دو ن ت حريك به وسيله ليگاند است كه ( 10 و 11 ) تكثير مستقل از فاكتور رشد دارند. جهش ITD حدود %25-%20 از مو ار د AML را شامل ميشود. جهش نقطهاي D835 هم در اگزون 20 ژن گيرنده FLT3 در موقعيت اسيد آمينه آسپارتيك اسيد 835 است كه حدودا در %6-10 بيماران AML مشاهده ( 12 و 13 ) ميشود. به دليل پيشآگهي بد در بيماران مبتلا به AML داراي جهش در ژن گيرنده FLT3 تحقيقات زيادي روي توسعه داروهاي بازدارنده فعاليت تيروزين كينازي (13) ITD وجود دارد. تضاعف توالي داخلي FLT3 ( 11 و 12 ) دراگزون و اينترون 11 اتفاق ميافتد و بين 9 تا 180 نوكلي وتيد (3 تا 60 اسيد آمينه) در اين نواحي افزوده ميشود كه باعث افزايش طول (14-16) ژن ميگردند. با توجه به گفتههاي فوق و اينكه تاكنون مطالعات چنداني بر روي اين جهشها در ايران انجام نشده است هدف از انجام اين پژوهش اجراي ي كردن تشخيص جهشهاي گيرنده FLT3 در ميان افراد مبتلا به AML بود. روش بررسي نمونههاي خوني تعداد 101 نفر از بزرگسالان مبتلا به AML با زيرگروههاي مختلف طبقهبندي FAB تهيه شده از بخش خون بيمارستانهاي دكتر شريعتي و مركز فلوسيتومتري سازمان انتقال خون (كه مراكز رفرانس هستند) با روش مشاهدهاي- توصيفي مورد مطالعه قرار گرفتند. از اين نمونهها جهت استخراج DNA از تكنيك پروتي يناز K و استات آمونيوم اشباع استفاده شد. لولههاي حاوي خون تا زمان تخليص DNA در فريزر نگهداري ميشوند. براي تشخيص ITD از DNA ژنوميك استخراج شده با استفاده از پرايمرهاي (زيست باران) GCA ATT TAG GTA TGA AAG CCA GC- 5' Reverse primer و Forward primer: -CTT TCA GCA TTT TGA CGG CAA CC- 5' 10μM و مطابق برنامه Initial denaturation PCR يك دوره به مدت 5 دقيقه در c 95 وسي سيكل تكراري كه هر سيكل شامل denaturation به مدت 1 دقيقه در دماي С 95 و 1 annealing دقيقه در 66 С و elongation به مدت 90 ثانيه در С 72 و در پايان final elongation به مدت 7 دقيقه در С 72 انجام شد. قبل از شروع PCR 50mM, dntp2mm) ژن) شامل (سينا master mix Buffer10X, Mgcl2 و) U μl Taq polymerase 5 (واحد در ميكروليتر) (سينا ژن) و ) μl DNA ) ng در حجم نهايي 50 ميكروليتر (μl) تهيه شد. پس از PCR با مشاهده مستقيم و مقايسه باندها با ماركر Gene Ruler Tm 50 bp DNA Ladder (سينا ژن) بر روي ژل پليآكريلاميد %8 به مدت 3-4 ساعت در ولتاژ 150 وجود جهش ITD بررسي شد. در مورد جهش نقطهاي D835 با استفاده از پرايمرهاي 10μlM (زيست باران) 5' reverse primer ' CCC-GCA GCC TCA CAT TGC و 3 Forward primer 5' TTG- -CCG CCA GGA ACG TGC 3' و مطابق برنامه PCR و مواد ذكر شده در بالا (در مورد جهش (ITD ژنوم استخراج شده بيماران تكثير شد. براي يافتن جهش نقطهاي D835 و براساس تكنيك RFLP و با استفاده از آنزيم u/μl) ECORV 10) (سيناژن) به مقدار 3μl و PCR از محصولات 26μl به ازاي هر 1μl R buffer (سيناژن) به مدت 12 ساعت در انكوباتور 80

3 تشخيص جهشهاي گيرنده FLT3 شامل تضاعف توالي داخلي گذاشته و در دماي С 37 انكوبه ميشوند. سپس محصولات RFLP را در روي ژل پليآكريلاميد %8 در ولتاژ 130 ب ه مدت 2 ساعت الكتروفورز ميشوند. پس از رنگآميزي در اتيديوم برمايد و سپس شستشو با آب مقطر وضعيت ژلها بررسي شده و نمونهها جهت م طال ع ه و براي عكسبرداري در دستگاه UV قرار داده ميشوند. در صورت وجود جهش و يا عدم آن باندهاي مختلف قابل مشاهده است. يافتهها الف: بررسي تضاعف توالي داخلي (ITD) از 101 بيمار مبتلا به AMLمورد بررسي در اين مطالعه با زيرگروههاي مختلف FAB (به جزء M6 وM7 ) %18 تضاعف توالي داخلي (ITD) را داشتند كه %16 آنها زيرگروه M 3 بودند. در شكل شماره 1 تعدادي از اين افراد ديده ميشوند كه در مورد آنها بعد از هر شكل توضيح داده شده است. در تمام اين موارد با شرايط يكسان و پرايمرهاي اختصاصي واحد 2 قطعه مختلف باند تكثير شده است كه باند پايينتر (360bp) مربوط به كلون نرمال سلولها و باند بالايي (> bp 360) مربوط به كلون سلولهاي جهش يافته لوسميك است كه در توالي داخلي اگزون 11 و 12 واينترون 11 تضاعف و جايگزيني اتفاق افتاده و طول اين ناحيه را از 360bp بالاتر برده است. ب: بررسي جهش نقطهاي D835 از 101 بيمارمبتلا به AML ميزان %6 ج هش نقطهاي و M5 و M3 را داشتندكه فقط در بيماران M2 (D835) اين جهش مشاهده شد. باندهاي موجود در شكل شماره شماره 2 محصولات PCR اگزون 20 (محل وقوع D835) را قبل از مواجه با آنزيم محدودالاثر ECORV در تعدادي از اين افراد را نشان ميدهد شكل شماره 1- جهش ITD در ژ ن FLT3 در زيرگروههاي مختلف بيماران M = Marker N = Negative control AML در شكل شماره 1 با توجه به ماركر قطعات 360 bp ديده ميشوند كه مربوط به اگزون 11 و 12 واينترون 11 ژن FLT3 ميباشد. نمونههاي فوق مربوط به زيرگروههاي متنوع طبقهبندي FAB هستند كه ستون 1 و 3 نمونه بيماران AML زيرگروه M3 هستند كه جهش در آنها ديده ميشود. ستون 9 مربوط به بيمار AML-M2 و ستو ن ش مار ه 14 مربوط به بيمار AML-M4 ميباشد. شكل شماره 2- تاييد PCR ژن طبيعيFLT3 (اگزون 20 )كه جهش نقطهاي D835 در اين ناحيه اتفاق ميافتد (مرحله قبل از اضافه كردن آنزيم) M = Marker N=Negative control در شكل شماره 3 محصولات PCR ش دة اگزون 20 ژن FLT3 ديده ميشوند كه بر اساس تكنيك RFLP آنزيم ECORV به آنها اضافه شده است. همانگونه كه مشاهده ميشود در تمام نمونهها برش DNA اتفاق افتاده به جز در ستونهاي شماره 5 و 13 كه در مقداري از محصولات برش DNA حادث نشده است. در حقيقت قطعات 114 bp از محصولات PCR شده كه به دو 81

4 قطعه 68 bp و 46 bp برش داده شدهاند نشان ميدهد كه در اين نمونهها جهش اتفاق نيفتاده است و مكان برش آنزيم كه ATC...3') (5'...GAT تغيير نكرده و آنزيم بهراحتي محصولات PCR را به دو قطعه كوچكتر به صورت كامل تقسيم كرده است ولي در بيماران شماره 5 و 13 باندهاي مختلف ديده ميشود كه باند بالايي همان باند 114 bp است كه به دليل وجود جهش مكان برش آنزيم تغيير نموده و آنزيم قادر به برش DNA نبوده است كه نشاندهنده وجود جهش نقطهاي D835 است. دو باند پايينتر يعني 68 bp و 46 bp ژنهاي كلون نرمال سلول در فرد مبتلا AML هستند كه جهش در اين كلونها اتفاق نيفتاده است. (18) پرگنوز بد گرايش دارد. در اين مطالعه براي يافتن ميزان بروز جهشهاي تضاعف توالي داخليITD و جهش نقطهاي D835 با تكنيك PCR و RFLP 101 فرد بزرگسال مبتلا به لوسمي ميلوي يدي حاد مورد مطالعه قرار گرفتند. از 101 بيمار مبتلا به لوسمي ميلوي يدي حاد %18 تضاعف توالي داخلي را نشان دادند كه پراكندگي يكساني در زيرگروههاي FAB نداشتند. بيشترين موارد در زيرگروه M3 مشاهده شد. در اين مطالعه مورد مثبتي از وجود جهش ITD در بيماران زيرگروه M0 و M1 و M5 ديده نشد. بررسي اين پژوهش نشان ميدهد كه جهشهاي FLT3/ITD در حدود %18 از لوسمي ميلوي يدي حاد بزرگسالان اتفاق ميافتد و تعدادي نوكلي وتيد اضافه و يا تكرار ميشود و درنتيجه وجود هر تعداد از اسيد آمينه اضافي باعث تغيير شكل فضايي پروتي ين شده و نهايتا اثر ناحيه مجاور غشايي پروتي ين را در جلوگيري از فعاليت اتوفسفوريلاسيون گيرنده از بين ميبرد. اين تكرارها ميتوانند در اگزون 11 و 12 و اينترون 11 از ژ ن FLT3 باشد و يا در مرز مشترك بين اگزون و اينترون 11 ( 19 و 20 ) اضافه شوند. شكل شماره 3- مشاهده جهش D835 در ژن FLT3 درزيرگروههاي مختلف بيماران AML (مرحله بعد از اضافه كردن آنزيم) M = Marker N=Negative control بحث جهشهاي FLT3 در پاتوژنز لوسميها ب ه خصوص AML اهميت بسزايي دارند و منجر به تكثير خارج از كنترل سلولهاي لوسميك ميشوند. تضاعف توالي داخلي ژن گيرنده FLT3 و جهش نقطهاي ( D835 )در (ITD) منجر به فعال شدن گيرنده بدون تحريك ب ه واسطه ليگاند (FL) ميشوند. جهش ITD در بعضي مطالعات به همراه شمارش لكوسيتي بالا پرگنوز بد و لوسمي مقاوم به (17) درمان گزارش شده است. هر چند D835 بر خلاف تركيبي از همه مطالعاتي كه تا امروز گزارش شده است شامل فراواني كلي از FLT3/ITD در AML بزرگسالان در 385 مورد از 1595 بيمار (حدود %24) بوده است. گزارشهاي ديگر حاكي از آن است ك ه FLT3/ITD در %20 تا %30 م وارد AML و همچنين D835 در %7 تا %10 اين بيماران رخ ( 18 و 21 ) ميدهد. FLT3/ITD در همه زيرگروههاي FAB با بيشترين نسبت در AML-M3 ديده شده است كه با مطالعه حاضر منطبق ميباشد. كمترين ميزان در AML- ( 21 و 22 ) M2 گزارش شده است. البته در گزارشهاي مختلف اين توزيع يكسان نيست و به طور كلي جهشهاي FLT3/ITD در بزرگسالان اغلب با يك (23-25) ITD با لكوسيتوز همراه نيست اما اندكي به سمت يك پيشآگهي بد دلالت دارد. 82

5 همچنين جهش اگزون 20 ژن گيرنده FLT3 بررسي شد كه دومين جهش از نظر فراواني است. در 101 بيمار مبتلا به لوسمي ميلوي يدي حاد تحت مطالعه در %6 اين جهش شناسايي شد و در افراد M0 M1 و M4 اين جهش مشاهده نشد. ب ه دليل كم بودن ميزان جهش و همچنين بيماران مورد مطالعه اين پژوهش به طور دقيق نميتوان رابطهاي بين وجود اين جهش و زيرگروههاي FAB تعريف كرد. جايگزيني D835 در 30 مورد از 429 بيمار مبت لا ب ه (%7) AML 1 مورد از 29 بيمار مبتلا به ALL %3) و 1 مورد از 36 بيمار مبتلا به (حدود MDS ( 18 و 26 ) (%3) مشاهده شده است. در يك گزارش مشابه 7 مورد از 35 بيمار مبتلا به (%7) AML اين جهش را (27) داشتهاند. در مطالعه حاضر فراواني درصد جهش D835 منطبق با گزارشهاي ديگران ميباشد. بروز جهش نقطهاي D835 ب ه طور معنيداري كمتر از ت ضاعف ت والي داخل ي (ITD) در ژن FLT3 م يباش د ولي هر دو جهش با فراواني بالايي در AML يافت ميشوند كه در مطالعه حاضر مجموعا %24 موارد را شامل شده است. اگرچه در مطالعهاي حاضر مواردي از وجود هر دو جهش تضاعف توالي داخلي (ITD) و جهش نقطهاي (D835) در ژن FLT3 در يك بيمار يافت نشد ولي حضور اين دو جهش در يك بيمار قبلا گزارش شده است كه البته با مطالعات تعيين توالي (sequencing) مشخص شده كه اين دو جهش بر روي يك آلل مشابه نبودهاند. بر خ لا ف جهشهاي تضاعف توالي داخلي (ITD) در مورد جهش نقطهاي D835 و استخلافهاي گوناگون آن اثرات پيشآگهي آنها ب ه طور معنيداري ثبت نشده است. به دليل فراواني بالاي جهش در ژن FLT3 (به خصوص (ITD يك تمركز شديد بر روي داروهاي بازدارنده فعاليت FLT3 تيروزين كنازي جهش يافته وجود دارد كه علاوه بر داروهاي رايج در پروتكلهاي استاندارد رايج در درمان AML داروهايي از قبيل CEP-701 تا حدود %94 در مورد بيماران داراي جهش ITD و %27 در موارد داراي جهش D835 اثر بازدارندگي بر تكثير سلولهاي لوسميك (28) و در نتيجه درمان AML دارند. از مح دوديته اي انجام اين پژوهش عدم دسترسي به پرونده بيماران جهت يافتن بعضي از اطلاعات آزمايشگاهي آنها بود. نتيجهگيري اين مطالعه نشان داد كه جهشهاي ژن گيرنده FLT3 درصد قابل توجهي از بيماران مبتلا به AML را شامل ميشود. در پايان اينكه پيگيري مناسب جهشهاي (D835 (ITD, در ژن گيرنده FLT3 و اجراي ي كردن روشهاي تشخيص مولكولار آنها به صورت روتين منجر به يك تصميمگيري مناسب در مديريت درمان لوسمي ميلوي يدي حاد شده و از اجراي پروتكلهاي درماني كم فايده ايجاد مقاومت به درمان و عودهاي مكرر جلوگيري به عمل ميآورد. تقدير و تشكر نويسندگان مقاله از معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي ايران جهت حمايت مالي مركز تحقيقات سلولي و ملكولي دانشگاه علوم پزشكي ايران جهت آزمايشها و از سازمان انتقال خون ايران و بيمارستان شريعتي به جهت تامين نمونههاي لازم نهايت تشكر را دارند. فهرست منابع 1- Savvides SN, Boone T, Andrew Karpluz P. FLT3 Ligand structure and unexpected Commonalities of 83 helical bundles and cystein knots. Nat Struct Biol 2000; 7:

6 2- Rosnet O, Schiff C, Pebusque MJ, Marchetto S, Tonnelle C, Toiron Y, et al. Human FLT3/FLK2 gene: cdna cloning and expression in hematopoietic cells. Blood 1993; 82: aspartic acid 814 in the function and expression of c-kit receptor tyrosine kinase. J Biol Chem 1996;271: Gilliland DG, Griffin JD. The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia. Blood 2002;100: delapeyriere O, Naquet P, Planche J, Marchetto, S., Rottapel, R. Expression of FLT3 tyrosine kinase receptor gene in mouse hematopoietic and nervous tissues. Differentiation 1995;58: Rosnet O, Birnbaum D. Hematopoietic receptors of class III receptor-type tyrosine kinases. Crit Rev Oncog 1993;4: Agnes F, Shamoon B, Dina C, Rosnet O, Birnbaum D, Galibert F. Genomic structure of the downstream part of the human FLT3 gene: exon/intron structure conservation among genes encoding receptor tyrosine kinases (RTK) of subclass III. Gene 1994;145: Birg F, Rosnet O, Carbuccia N, Birnbaum D. The expression of FMS, KIT and FLT3 in hematopoietic malignancies. Leuk Lymphoma 1994;13: Birg F, Courcoul M, Rosnet O, Bardin F, Pébusque MJ, Marchetto S, et al. Expression of the FMS/KIT-like gene FLT3 in human acute leukemias of the myeloid and lymphoid lineages. Blood 1992;80: Piacibello W, Fubini L, Sanavio F, Brizzi MF, Severino A, Garetto L, et al. Effects of human FLT3 ligand on myeloid leukemia cell growth: heterogeneity in response and synergy with other hematopoietic growth factors. Blood 1995;86: DaSilva N, Hu ZB, Ma W, Rosnet O, Birnbaum D, Drexler HG. Expression of the FLT3 gene in human leukemia-lymphoma cell lines. Leukemia 1994;8: Kaspers GJL, Smets LA, Pieters R, Van Zantwijk CH, Van Wering ER, Veerman AJP. Favorable prognosis of hyperdiploid common acute lymphoblastic leukemia may be explained by sensitivity to antimetabolites and other drugs: results of an in vitro study. Blood 1995;85: Zwaan CM, Kaspers GJL, Pieters R, Ramakers- Van Woerden NL, den Boer ML, et al. Cellular drug resistance profiles in childhood acute myeloid leukemia: differences between FAB-types and comparison with acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000;96: Moriyama Y, Tsujimura T, Hashimoto K, Morimoto M, Kitayama H, Matsuzawa Y, et al. Role of 14- Hayakawa F, Towatari M, Kiyoi H, Tanimoto M, Kitamura T, Saito H. Tandem-duplicated FLT3 constitutively activates STAT5 and MAP kinase and introduces autonomous cell growth in IL-3-dependent cell lines. Oncogene 2000;19: Kiyoi H, Towatari M, Yokota S, Hamaguchi M, Ohno R, Saito H, et al. Internal tandem duplication of the FLT3 gene is a novel modality of elongation mutation which causes constitutive activation of the product. Leukemia 1998;12: Mizuki M, Fenski R, Halfter H, Matsumura I, Schmidt R, Müller C, et al. FLT3 mutations from patients with acute myeloid leukemia induce transformation of 32D cells mediated by the Ras and STAT5 pathways. Blood 2000;96: Choi Y, Kim HJ, Park BH, Min WS, Kim CC. Novel mutations in the FLT3 gene in adult patients with refractory acute myeloid leukemia. Br J Hematol 2005; 108: Yamamoto Y, Kiyoi H, Nakano Y, Suzuki R, Kodera Y, Miyawaki S, et al. Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies. Blood 2001;97: Kelly LM, Liu Q, Kutok JL, Williams IR, Boulton CL, Gilliland DG. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood 2002;99: Abu-Duhier FM, Goodeve AC, Wilson GA, Gari MA, Peake IR, Rees DC, et al. FLT3 internal tandem duplication mutations in adult acute myeloid leukaemia define a high-risk group. Br J Haematol 2000;111: Nakao M, Yokota S, Iwai T, Kaneko H, Horiike S, Kashima K, et al. Internal tandem duplication of the FLT3 gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia 1996;10: Iwai T, Yokota S, Nakao M, Okamoto T, Taniwaki M, Onodera N, et al. Internal tandem duplication of the FLT3 gene and clinical evaluation in childhood acute myeloid leukemia. The Children's Cancer and Leukemia Study Group, Japan. Leukemia 84

7 1999;13: Williams DE. In vivo effects of FLT3 ligand. Blood 1997;90:5022a. 24- Fröhling S, Breitruck J, Schlenk R, Kreitmeier S, Tobis K, Döhner H, et al. FLT3 internal tandem duplications and survival in adult acute myeloid leukemia: analysis of 188 intensively treated patients. Blood 2001;89:717a. 25- Rombouts WJ, Blokland I, Lowenberg B, Ploemacher RE. Biological characteristics and prognosis of adult acute myeloid leukemia with internal tandem duplications in the FLT3 gene. Leukemia 2000;14: Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB, Pieters R, den Boer ML, Minden MD, et al. MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nat Genet 2002;30: Fenski R, Flesch K, Serve S, Mizuki M, Oelmann E, Kratz-Albers K. Constitutive activation of FLT3 in acute myeloid leukaemia and its consequences for growth of 32D cells. Br J Haematol 2000;108: Kelly LM, Yu JC, Boulton CL, Apatira M, Li J, Sullivan CM. CT53518, a novel selective FLT3 antagonist for the treatment of acute myelogenous leukemia (AML). Cancer Cell 2002;1:

8 Diagnosis of FLT3 Mutations Including Internal Tandem Duplication and D835 Aspartic Acid Point Mutation in Patients with Acute Myeloid Leukemia *F. Zaker, PhD I M. H. Mohammadi. MSc II A. Kazemi, PhD III M. Bakhshayesh, MSc IV Abstract Background and Aim: Molecular basis of Acute Myeloid Leukemia (AML) involves mutations in regulatory genes of cellular proliferation and differentiation.mutation in tyrosine kinase receptor gene of FLT3 occurs in high frequency in AML, resulting in proliferation and abnormal survival of leukemia cells. Mutations in Internal Tandem Duplication (ITD) and D835 of FLT3 gene are associated with poor prognosis.the aim of this study was to diagnose and determine the frequency of this mutation in AML. Materials and Methods: This descriptive - observational study was performed on 101 AML patients for mutations in exon 11,12 and interon 11 of ITD and D835 mutation in exon 20 of FLT3 receptor gene using PCR.Mutation in ITD was observed using PCR products run on acrylamid gel 8% and compared to marker. PCR products of D835 mutation on genomic DNA were studied using ECORV restriction enzyme and RFLP technique. Results: ITD mutation was observed in 18% of AML studied patients with differences in subgroups of FAB. Also 6% of the patients showed D835 mutation with difference in subgroups of FAB. Conclusion:This study revealed that mutations in FLT3 gene occurr in substantial number of AML patients. Therefore,molecular diagnosis of these mutations prior to treatment leads to a better decision making for the therapeutic protocol. Key words: 1) AML (Acute Myeloid Leukemia) 2) FLT-3 (Fms Like Tyrosin kinase 3) ITD (Internal Tandem Duplication) 4) D835 (Aspartic Acid 835) 5) PCR (Polymerase Chain Reaction) This article is a summary of the thesis by M.H Mohammadi for the degree of MSc in Hematology under supervision of F.Zaker, Ph.D. and consultation with A.Kazemi, Ph.D. (2006) I) Associate Professor of Hematology, Cellular and Molecular Research Center, Faculty of Paramedical Sciences, Crossing of Hemmat and Chamran Expressways, Iran University of Medical Sciences and Health services Tehran, Iran (* Corresponding Author) II) MSc in Hematology, Faculty of Paramedical Sciences, Iran University of Medical Sciences and Health Services, Tehran, Iran III) Associate Professor of Hematology, Faculty of Paramedical Sciences, Iran University Of Medical Sciences and Health Services, Tehran, Iran IV) MSc in Parasitology, Cellular and Molecular Research Center, Iran University Of Medical Sciences and Health Services, Tehran Iran 86